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RNA pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)

更新時(shí)間:2021-09-23點(diǎn)擊次數(shù):4150

RNA pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)


1. 實(shí)驗(yàn)原理

RNA pull down是體外研究RNA與蛋白互作的重要技術(shù)。該技術(shù)是用生物素標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄的靶RNA分子,再用鏈霉親和素純化出與靶RNA結(jié)合的蛋白復(fù)合體,洗脫得到RNA結(jié)合蛋白質(zhì)。再通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與靶RNA結(jié)合;或通過(guò)質(zhì)譜儀檢測(cè)可以篩選出與靶RNA結(jié)合的蛋白。

生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度最高的非共價(jià)作用;其中活化生物素可以在蛋白質(zhì)交聯(lián)劑的介導(dǎo)下,與已知的幾乎所有生物大分子偶聯(lián)。因此用生物素標(biāo)記核酸后,可以純化出與該核酸結(jié)合的各種生物大分子復(fù)合物。

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2. 實(shí)驗(yàn)流程

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1)探針設(shè)計(jì)及標(biāo)記:體外轉(zhuǎn)錄或合成獲取RNA,生物素標(biāo)記;

2)pull down:與細(xì)胞裂解液孵育,形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素磁珠結(jié)合,從而把靶RNA結(jié)合蛋白從細(xì)胞裂解液中分離出來(lái),經(jīng)過(guò)洗滌將非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)去除;最后,洗脫得到與靶RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物;

3)互作蛋白質(zhì)鑒定:再經(jīng)過(guò)Western Blot(WB)或質(zhì)譜(MS)鑒定蛋白質(zhì)。

3. 服務(wù)內(nèi)容

1)體外轉(zhuǎn)錄或合成RNA,生物素標(biāo)記;

2)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞裂解液制備;

3)pull down捕獲互作蛋白;

4)Western blot驗(yàn)證互作蛋白;

5)MS篩選鑒定互作蛋白。

4. 交付結(jié)果

1)提供詳細(xì)、完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告;

2)客觀公正的原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果。

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